高效液相色譜儀基本原理、應(yīng)用及常見故障
1、高效液相色譜儀的系統(tǒng)組成、工作原理
高效液相色譜儀的系統(tǒng)由儲液器、泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測器、記錄儀等幾部分組成。儲液器中的流動相被高壓泵打入系統(tǒng)，樣品溶液經(jīng)進(jìn)樣器進(jìn)入流動相，被流動相載入色譜柱（固定相）內(nèi)，由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數(shù)，在兩相中作相對運(yùn)動時，經(jīng)過反復(fù)多次的吸附- 解吸的分配過程，各組分在移動速度上產(chǎn)生較大的差別，被分離成單個組分依次從柱內(nèi)流出，通過檢測器時，樣品濃度被轉(zhuǎn)換成電信號傳送到記錄儀，數(shù)據(jù)以圖譜形式打印出來。
2、高效液相色譜儀的應(yīng)用
高效液相色譜法只要求樣品能制成溶液，不受樣品揮發(fā)性的限制，流動相可選擇的范圍寬，固定相的種類繁多，因而可以分離熱不穩(wěn)定和非揮發(fā)性的、離解的和非離解的以及各種分子量范圍的物質(zhì)。與試樣預(yù)處理技術(shù)相配合，HPLC所達(dá)到的高分辨率和高靈敏度，使分離和同時測定性質(zhì)上十分相近的物質(zhì)成為可能，能夠分離復(fù)雜相體中的微量成分。
隨著固定相的發(fā)展，有可能在充分保持生化物質(zhì)活性的條件下完成其分離。HPLC成為解決生化分析問題最有前途的方法。由于HPLC具有高分辨率、高靈敏度、速度快、色譜柱可反復(fù)利用，流出組分易收集等優(yōu)點(diǎn)，因而被廣泛應(yīng)用到生物化學(xué)、食品分析、醫(yī)藥研究、環(huán)境分析、無機(jī)分析等各種領(lǐng)域。高效液相色譜儀與結(jié)構(gòu)儀器的聯(lián)用是一個重要的發(fā)展方向。液相色譜- 質(zhì)譜連用技術(shù)受到普遍重視，如分析氨基甲酸酯農(nóng)藥和多核芳烴等；液相色譜- 紅外光譜聯(lián)用也發(fā)展很快，如在環(huán)境污染分析測定水中的烴類，海水中的不揮發(fā)烴類，使環(huán)境污染分析得到新的發(fā)展。
3、高效液相色譜儀常見故障處理
LC-10AT高效液相色譜儀是日本島津公司1996年的產(chǎn)品，檢測器為可變波長紫外檢測器，色譜柱為島津公司的ODS-C18，大連依利特的ODS-C18。八年的日常工作中遇到了幾種故障，如故障1經(jīng)咨詢島津公司的工程師后，得以解決；故障2、故障5是頻繁碰到的問題等，特作總結(jié)如下：
故障1 流動相內(nèi)有氣泡，關(guān)閉泵，打開泄壓閥，打開purge鍵，清洗脫氣，氣泡不斷從過濾器冒出，進(jìn)入流動相，無論打開purge鍵幾次，都無法清除不斷產(chǎn)生的氣泡。
原因過濾器長期沉浸于乙酸銨等緩沖液內(nèi)，過濾器內(nèi)部由于霉菌的生長繁殖，形成菌團(tuán)，阻塞了過濾器，緩沖液難以流暢地通過過濾器，空氣在泵的壓力作用下經(jīng)過濾器進(jìn)入流動相。
處理過濾器浸泡于5%硝酸溶液中，超聲清洗幾分鐘即可；亦可將過濾器浸泡于5%硝酸溶液中12～36小時，輕輕震蕩幾次，再將過濾器用純水清洗幾次，打開泄壓閥，打開purge 鍵，清洗脫氣，如仍有氣泡不斷從過濾器冒出，繼續(xù)將過濾器浸泡于5%硝酸溶液中，如沒有氣泡不斷從過濾器中冒出，說明過濾器內(nèi)部的霉菌菌團(tuán)已被硝酸破壞，流動相可以流暢地通過過濾器。打開泄壓閥，打開泵，流速調(diào)至1.0～3.0ml/min ，純水沖洗過濾器1小時左右。即可將過濾器清洗干凈。關(guān)閉泄壓閥，純甲醇沖洗半小時即可。
故障2 柱壓高
原因（1）緩沖液鹽分如（乙酸銨等）沉積于柱內(nèi)；（2）樣品污染沉積。
處理對于第一種情況先用40～50 ℃的純水，低速正向沖洗柱子，待柱壓逐漸下降后，相應(yīng)提高流速沖洗，柱壓大幅度下降后， 用常溫純水沖洗，之后用純甲醇沖洗柱子30 分鐘；對于第二種情況，由樣品的沉積引起污染的C18柱，用純水反向沖洗柱子， 然后換成甲醇沖洗，接著用甲醇+異丙醇（4+6）沖洗柱子（沖洗時間的長短由樣品污染的情況而定），再用換成甲醇沖洗，然后用純水沖洗，最后甲醇沖洗正向沖洗柱子30分鐘以上。
故障3 既無壓力指示，又無液體流過。
原因（1）泵密封墊圈磨損；（2）大量氣泡進(jìn)入泵體。
處理對于第一種情況，更換密封墊圈；對于第二種情況，在泵作用的同時，用一個50ml的玻璃針筒在泵的出口處幫助抽出空氣。
故障4 壓力波動大，流量不穩(wěn)定。
原因系統(tǒng)中有空氣或者單向閥的寶石球和閥座之間夾有異物，使得兩者不能密封。
處理工作中注意觀察流動相的量， 保證不銹鋼濾器沉入儲液器瓶底，避免吸入空氣，流動相要充分脫氣。如為單向閥和閥座之間夾有異物，拆下單向閥，放入盛有丙酮的燒杯用超聲波清洗。
故障5 出峰不佳，峰分叉。
原因（1）色譜柱被污染；（2）柱頭填料塌陷。
處理對于第一種情況，先用純水反向沖洗柱子，然后換成甲醇沖洗，接著用甲醇+異丙醇（4+6）沖洗柱子（沖洗時間的長短由樣品污染的情況而定），再換成甲醇沖洗，然后用純水沖洗，最后甲醇沖洗正向沖洗柱子30分鐘以上。如沖洗后依然出峰不佳，則考慮第二種情況。對于第二種情況，擰開柱頭，檢查柱填料是否硬結(jié)或塌陷。去除硬結(jié)部分（污染的填料），裝入新填料，滴一滴甲醇，填料下陷，再填，用與柱內(nèi)徑相同的頂端平滑的不銹鋼桿壓緊，再填平，滴甲醇，再壓緊反復(fù)幾次，直至裝滿填平。柱頭用甲醇沖洗干凈，擦凈柱外壁的填料，擰緊柱頭，用純甲醇沖洗30分鐘以上。
故障6 峰面積重復(fù)性不佳。
原因（1）進(jìn)樣閥漏液；（2）加樣針不到位。
處理對于第一種情況更換進(jìn)樣閥墊圈；對于第二種情況保證加樣針插到底，注射樣品溶液后須快速、平穩(wěn)地從LOAD狀態(tài)轉(zhuǎn)換到INJECT 狀態(tài)，以保證進(jìn)樣量的準(zhǔn)確。日常工作中，液相色譜儀的保養(yǎng)非常重要，如要注意不要讓空氣進(jìn)入輸液系統(tǒng)和高壓泵中，儲液器內(nèi)的溶液如長時間未用應(yīng)清洗儲液器并更換溶液，每次用完色譜儀后緩沖液要用純水沖洗干凈，防止無機(jī)鹽析出或沉積；樣品的前處理也很重要，任何樣品都要盡可能地去除雜質(zhì)，完quan溶解，盡量減少對色譜柱的污染，以延長色譜柱的使用壽命，同時避免注射過濃的樣品溶液，以免殘留液在進(jìn)樣閥內(nèi)析出固體引起堵塞；色譜柱作好標(biāo)記，用于不同分析目的的色譜柱不要混用等。
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